作者shokugeki (食戟)
看板Biotech
标题[求救] 切胶纯化後还是有杂band
时间Sun Jul 15 14:54:09 2018
大家好
现在我在用pfu pcr扩增一个片段。用的酵素是Agilent的PfuUltra II Fusion HotStart
DNA Polymerase；template是之前建构好的plasmid，每一次下的浓度约700ng/ul；prime
r长度是60mer(之前是拿来建构plasmid用的，所以有点长)。pcr後跑胶除了主要band(137
8bp)外，在2.5～3k的地方出现了不明显的杂band，之後切胶纯化主要band後再跑胶确认
还是有杂band。
为了除去杂band，我试着把pcr annealing温度提高、extension秒数缩短让它最大只能做
到2k，但都不行。
也有把水当template来跑跑看，结果是什麽band都没有。
想请问各位这是发生什麽事了？有没有方法能除去杂band呢？
感谢各位
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 140.121.155.195
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1531637652.A.D62.html
1F：→ blence: 700ng/ul,做出来的PCR产物应该也没这麽多 07/16 07:10
2F：→ Ianthegood: 重做primer 要过胶纯化 07/17 00:49
3F：→ xxtomnyxx: 我猜那个杂band是你的template 07/17 05:05
4F：推 mtcoat: template是之 前建构好的plasmid为何要用到700ng/ul? 我 07/18 21:33
5F：→ mtcoat: 整个反应都只加10ng 另外primer建议重新设计长度在20-23 n 07/18 21:33
6F：→ mtcoat: t即可 07/18 21:33
7F：推 Nicoleching: 切胶完之後再跑胶又在2.5-3kb出现一模一样的杂band? 08/14 20:06
8F：→ Nicoleching: 会不会是你产物的2或3级结构？ 08/14 20:07