作者yaliu (雅)
看板Biotech
标题[求救] RNA去除gDNA的方法
时间Thu Aug 16 11:59:30 2018
大家好，最近在抽乳酸菌的RNA，但总是会有gDNA的污染，
因为後续要做QPCR，原核生物也无法用引子避开DNA的污染的问题。
我是用Qiagen的抽RNA kit，也买了DNase做on-column或者elution之後gDNA的去除，
但总是去不乾净.....>"<
都改成37度反应30min了还不行(kit是建议20-30度10-15min)，
跑电泳是看不到gDNA那条band，但我将RNA直接PCR 16S基因就是有band，还颇亮.....
已经不知道要改什麽了....
另外，kit是说建议菌量<1e+9 cfu，
可是我使用这个菌量下去萃RNA浓度就是很低阿，10-20ng/ul(最後只elute 30ul)
所以只能提高菌量，有人一样用这个kit萃这种菌数可以得到很高浓度的RNA吗??
当然因为实验的关系我是抽stationary phase的RNA，不过有可能低成这样吗??
另外培养基很复杂，不是那种MRS养的..
破菌是采用bead的方法，还是用lysozyme会比较好??
请问有没有人抽G(+)细菌RNA然後没有gDNA的污染的，
是用什麽方法抽的??如果是用kit的最好，感谢大家!!!
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※ 编辑: yaliu (118.163.159.117), 08/16/2018 12:02:07
1F：→ ernielwl: 我之前也用Qiagen家的RNA kit抽真菌,确实On-column的除08/16 19:39
2F：→ ernielwl: 不乾净 08/16 19:39
3F：→ ernielwl: 好奇的是你看不到gDNA的band,那16s 23s 5s都清楚吗08/16 19:44
16s 23s看的到，5s很淡几乎没有
不过直接PCR 16S还是很亮，
上qPCR CT值还是20几...
所以跑胶看有没有gDNA污染看起来也不太可信，
还是PCR最准!!
4F：→ ernielwl: 如果kit不行是建议换Trizol,用分层的污染会少很多,过col 08/16 19:45
5F：→ ernielwl: umn多少都会残留08/16 19:45
想说trizol是最後一步
6F：→ huuban: 用Trizol抽回收量应该有机会column高吧 08/16 22:04
7F：→ huuban: 我们实验室有时候DNase会吃两趟，给您参考08/16 22:04
没错，我最後也是吃两次才"比较乾净"，
PCR很弱band,
qPCR看不到(有稀释成假设转cDNA要上机的浓度)，
不过我是做两次的on-column,
等於就会再浪费一个column了，
想要试试可不可以反应第一次後离掉，
直接再加DNase反应第二次...
(都做两次了PCR还有弱band是怎样...)
8F：推 lingon: trizol 最乾净, 抽完再用DNase, DNase 用的次数也不要太多08/16 22:51
9F：→ lingon: 用多了还是会影响RNA quality08/16 22:51
10F：推 Ianthegood: turbo dnase, $$$, 但是比较强08/17 01:20
11F：→ Ianthegood: trizol比较高应该是总量超过column的capacity是才明08/17 01:21
12F：→ Ianthegood: 显吧08/17 01:21
13F：→ a90648: 我们LAB有些人是Trizol分层後再用column08/17 11:51
业务有提供另一款RNAeasy plus的，
也是类似trizol分层，但是是期货，
想说如果真的要花掉两个column就要改买这一组了...
※ 编辑: yaliu (223.138.123.221), 08/17/2018 18:30:03
14F：推 michealking: trizol 产粮比较高 要clean再过column 08/18 12:15
15F：→ michealking: 另外不可以多样品混合吗？ 08/18 12:16
16F：→ TigerDuck118: 弱弱问一下 16sRNA本来就超浓 然後PCR看的到 08/19 16:52
17F：→ TigerDuck118: 表示仍有gDNA污染 是一定的吗? 08/19 16:52
18F：推 ernielwl: 回楼上,你要一个做对照组,如果超浓你下去当template的量 08/20 08:54
19F：→ ernielwl: 也许就会看得到band,然後理论上用oligo dT primer做成cD 08/20 08:54
20F：→ ernielwl: NA是p不到rRNA的,但是RNA quality很好的时候我个人经验 08/20 08:54
21F：→ ernielwl: 还是会p到rRNA,如果是真核生物比较好解决找一对含intron 08/20 08:54
22F：→ ernielwl: 基因的primer 去P,如果有DNA污染就会看到含intron的那 08/20 08:54
23F：→ ernielwl: 条band,但是楼主是细菌,最好找一段确定不会表现的基因 08/20 08:54
24F：→ ernielwl: 来check 08/20 08:54
25F：→ huuban: Trizol应该可以提高回收量，但我抽的样本trizol抽不动XD 08/20 12:11
26F：→ huuban: turbo dnase好用，我们要吃两趟的样本用Turbo都是一趟就好 08/20 12:12
27F：→ Ice9: 试试加 DpnI 处理。 08/31 00:55