作者nm768417 (opport)
看板Biotech
标题Western Blot有结果，SDS-page却没有
时间Tue May 25 16:59:09 2021
这是我的western
https://i.imgur.com/TVfCx4Y.jpg
这张是page
https://i.imgur.com/v6o9BWj.jpg
Western 有在目标大小上（16KDA左右），但page没有
而且还有其他的band
样本：0.5mM IPTG诱导纯化後的elute 五管+1mM IPTG五管（结果比较明显看到是两个wel
l而已）
煮蛋白时间：95度 五分钟
跑电泳时间：150V 300A 75分
转渍：300V 400A 150分
由於实验室的机器好像是只能拿来跑DNA的
所以电流或是电压会有点不稳
因实验室还未购置新机器
所以只能勉强用
Comassie blue室温染overnight
退染在烘箱65度 overnight
以上步骤都是按照先前实验室学长姐留下来的
且在做诱导前就有先直接煮蛋白（未破菌）
以下这张图在跑电泳的时候有去动到或是配buffer有错（有点忘记什麽原因）所以有点丑
WB附图
https://i.imgur.com/xnoD002.jpg
会是什麽原因导致western blot有，但page没结果
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 114.137.158.128 (台湾)
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1621933152.A.172.html
※ 编辑: nm768417 (114.137.158.128 台湾), 05/25/2021 17:01:46
1F：→ Qaaaa: 染SDSPAGE的染法可以换用银染 也许单纯浓度不够05/25 17:26
2F：→ nm768417: 有去做braford assay浓度有200多ug 这样算高吗05/25 17:46
3F：→ Qaaaa: 如果蛋白质浓度爆高确染不出来 那可能先看看染剂有无配错05/25 18:00
4F：→ nm768417: 了解 实验室的染剂是从之前就一直用到现在 搞不好会有一05/25 21:47
5F：→ nm768417: 些问题也是有可能05/25 21:47
6F：推 Ianthegood: coomassie sensitivity本来就低 然後你的protocol满奇05/26 03:47
7F：→ Ianthegood: 妙的05/26 03:47
8F：→ xxtomnyxx: 电源供应器就只是个电源供应器，不会特地去分跑DNA跑蛋05/26 10:54
9F：→ xxtomnyxx: 白质的，然後应该是 150V，300mA吧？而且实际上跑的时05/26 10:55
10F：→ xxtomnyxx: 候应该是跑不到300mA的，Transfer适用半乾吗？300V很高 05/26 10:57
11F：→ xxtomnyxx: 耶？05/26 10:57
12F：→ xxtomnyxx: 第一张图比较有可能是PAGE的问题，因为连 Marker都跑得05/26 10:59
13F：→ xxtomnyxx: 很糟；第二张图应该是染剂坏了，因为连Marker都染不太05/26 10:59
14F：→ xxtomnyxx: 到；第三张图比较可能是Sample的问题，因为Marker跑得05/26 11:00
15F：→ xxtomnyxx: 不错，我会觉得是overloading。然後你的marker真神奇，05/26 11:01
16F：→ xxtomnyxx: 竟然会在WB跟sample一起呈色？05/26 11:01
17F：推 tynse71864: 有些 marker真的会 XD05/26 11:44
18F：→ nm768417: 是300mA05/26 12:04
19F：→ nm768417: 第三张图是WB 抱歉没有说明清楚（已更新05/26 12:07
※ 编辑: nm768417 (114.137.158.128 台湾), 05/26/2021 12:07:38
20F：→ nm768417: 用的是湿式 05/26 12:08
21F：推 Ice9: 纯化不好，有杂bands正常。 05/26 14:51
22F：→ Ice9: 诱导前直接煮蛋白是什麽意思？ 05/26 14:51
23F：→ Ice9: 每个well你下多少的量？ 05/26 15:00
24F：→ nm768417: 诱导前煮蛋白意思是说，我有试过没有破菌直接煮跟破菌 05/26 17:59
25F：→ nm768417: 後跑纯化的 05/26 17:59
26F：→ nm768417: 每个well下20 ul 05/26 17:59
27F：→ Ice9: 我们家普通染色会加 BSA至少一个 well当对照 05/27 07:07
28F：→ Ice9: 所以你每个well至少 4ug，但你目标蛋白可能还不到 100ng， 05/27 07:07
29F：→ Ice9: 所以看不出来 05/27 07:07
30F：→ Ice9: marker的量可以当粗略的参考来比对 05/27 07:13
31F：→ skykoc: CBB跟WB敏感度差非常多 以前纯化完蛋白CBB看到一条band， 06/11 23:43
32F：→ skykoc: 把他稀释50倍跑WB，整个band是炸开的。 06/11 23:43