作者soyokenny (soyokenny)
看板Biotech
标题[求救] western blot问题
时间Tue Dec 17 18:56:53 2024
（手机排版 乱掉抱歉）
各位前辈先进大家好
最近在用western blot跑小分子蛋白（17kda)
但band总是跑出奇怪的形状，如附图（非常丑请见谅）
https://i.imgur.com/7jeWYfh.jpeg
连internal control (42kda)都出现拖尾的现象，如附图
https://i.imgur.com/frrTqXF.jpeg
我是使用15% SDS-PAGE 1.5mm
蛋白loading 10到30ug都试过，体积也是试过10ul-30ul
上胶用75v跑到上胶底端，下胶用100v跑到快跳海
Transfer是使用PVDF膜（methanol浸泡1分钟），100v 90min（塞冰桶，拿出来液体是冰
的）
Blocking用5% BSA室温两小时，一抗用BSA照data sheet 1:2000稀释 4度overnight，二
抗也是照data sheet用BSA 1:2000稀释，室温两小时，Blocking跟染抗的每个步骤中间都
用TBST wash三次，每次五分钟，最後ECL 1:1配好加1ml压片。
照上述过程都还是有相同的情况，本来怀疑是我制胶的问题，所以有试过用commercial g
el也是相同情况，怀疑是transfer的问题所以有试过湿式跟半乾式，但也没有改变。
麻烦各位先进前辈了！谢谢！
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1F：推 maurice9325: 看起来是胶或是蛋白有问题。胶借别人的材料试试看，12/17 20:28
2F：→ maurice9325: 或是请跑出来正常的人帮你配一片胶。另外蛋白质如果12/17 20:28
3F：→ maurice9325: 是直接收没定量或是组织检体，建议重复冷冻後多煮几12/17 20:28
4F：→ maurice9325: 次。12/17 20:28
5F：推 maurice9325: 阿阿，没看到已经有用其他胶。那marker漂亮吗，试试12/17 20:30
6F：→ maurice9325: 看从蛋白前处理改善看看。因为从fig 2，可以看到跑12/17 20:30
好的感谢
7F：→ maurice9325: 完胶的结果就很怪了。12/17 20:30
8F：推 Qaaaa: 看起来像样品没纯化乾净 很多时候如gDNA没去掉 大分子会在12/17 21:20
好的，我再试试DNase跟sonication
9F：→ Qaaaa: 跑胶时於上方拉扯而变成这种撕咬感12/17 21:21
10F：→ xxtomnyxx: 42 kDa拖条除了DNA以外，还有可能是下太多蛋白了 12/17 22:03
一开始下10ug的蛋白，但17那条太少了看不到，42还是有拖尾的现象
11F：→ xxtomnyxx: 你的 transfer buffer 配方是什麽？有加SDS吗？12/17 22:04
我是直接买bio-rad commercial 的transfer buffer来稀释，没有加SDS
12F：→ xxtomnyxx: 顺便问个你用的跑胶系统是哪个厂牌的？12/17 22:07
跑胶、transfer的机器跟buffer都是用bio-rad的
※ 编辑: soyokenny (123.195.77.180 台湾), 12/17/2024 23:04:39
13F：推 darrenyo: Marker如果没歪样本歪那就是 样本前处理的问题吧12/18 13:47
14F：推 Renina: 跟厂商要pre casting gel试用品跑一次看看，看起来就是胶12/25 13:22
15F：→ Renina: 的问题12/25 13:22
16F：→ Renina: glycine有没有受潮呢 12/25 13:22
17F：→ Renina: 其他东西有没有过期或是混到别的液体，浓度有没有配错呢 12/25 13:22
18F：推 jockersung: 已私有可能是盐类跟dna等等的影响。除了加dnase外，可 12/26 19:15
19F：→ jockersung: 以用cutting column 去掉10k（或是5k 1k的）以下的跑 12/26 19:15
20F：→ jockersung: 看看 12/26 19:15
21F：推 tynse71864: 想问样品怎麽处理的? 我家也是 biorad commercial全套 12/28 20:54
22F：→ tynse71864: 但偶尔发现样品很黏稠 (太浓或有 DNA ) 就可能会这 12/28 20:54
23F：→ tynse71864: 样12/28 20:54
24F：推 nuwoos: 小分子蛋白跑到一半就要停吧。01/03 23:10
※ 编辑: soyokenny (118.169.82.38 台湾), 02/04/2025 16:29:28