作者bill00202000 (handsome)
看板Chemistry
标题[实验] HPLC 定量与peaK问题(初学者)
时间Fri Feb 2 22:54:12 2018
机型:Hitachi 5110
管住:NH2P-50 4E
size: 4.6 (ID), 250(Length)
particle size(um) : 5
移动相:75% 乙腈
流速: 1 ml/min
侦测器: RI dector, 5450 refraction index detector(Hitachi)
因为前人的数据有问题，老板希望解决，所以小弟要打HPLC，修正此问题，但小弟从未碰
过，所以想请教各位大神一些问题，
其问题是样品经过酵素反应後，经过稀释并加入乙腈调整至75%，打HPLC侦测剩下多少糖
类和合成多少，结果Total的量超过原本反应前的含量，老板推测是lactose和sucrose定
量有问题，因为样品中的lactose(9分钟)和sucrose(8分钟)之peak无法分开(如图:
https://imgur.com/a/Z0vZr，但参考各文献除机型外，其余条件相同，lactose和
sucrose之peak却可以完全分开，不知是因为机型问题还是其他原因?
若lactose和sucrose之peak无法分开，定量面积(面积是系统自己计算)会受到影响吗?
那是否可以用lactose和sucrose混合後打HPLC制成一条标准曲线，再去定量前人结果吗?
若要将两者peak分开，除调整移动相浓度外，温度和流速会有影响吗?
最後的问题是，若更改条件将lactose和sucrose之peak分开，以此条件，将lactose和
sucrose混打制成标准曲线，再用原本条件将lactose和sucrose混合後(peak未分开)制成
标准曲线，两者曲线比较找出换算的系数，把前人的数据带入後修正结果，此法是否能修
正前人定量的问题
麻烦各位大神可解答小弟疑惑，感恩不尽
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 140.120.104.80
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Chemistry/M.1517583254.A.CCB.html
※ 编辑: bill00202000 (140.120.104.80), 02/02/2018 22:56:46
1F：→ jerry9437: Column效能是否有降低？ 02/03 09:18
column是新的，效能应该不会这麽快降低
※ 编辑: bill00202000 (110.28.73.101), 02/03/2018 14:36:25
2F：推 zxcvb25206: 尽管都是c18的管柱 也会因为特性不同 而有不同rt 能吧02/03 18:51
3F：→ zxcvb25206: peak分开的方法有很多 最重要你要先要概念02/03 18:51
4F：推 zxcvb25206: 文献给的参数不是通用的 多少会有些微差异 而不同条 02/03 18:53
5F：→ zxcvb25206: 件的数据也不能混合使用 哪有这麽省事的啊02/03 18:53
6F：→ zxcvb25206: 你那样算造假了 因为不是用新条件跑出来的 02/03 18:54
7F：推 zxcvb25206: 温度 管柱长度 移动相比例 流速都会影响 你要先有概02/03 19:42
8F：→ zxcvb25206: 念 才知道要动哪个参数 但就算try出新条件 你终究要02/03 19:42
9F：→ zxcvb25206: 重做前人的样品重新分析 没有什麽可以换算的 论文造 02/03 19:42
10F：→ zxcvb25206: 假没听过吗？ 02/03 19:42
11F：→ tony15899: 请写出管柱规格 02/05 12:51
感谢楼上的回答，换算这件事我知道不可以，但此方式不是我能说不要，头上的人吩咐，
虽然有反应过，呵呵～
管注规格:
NH2P-50 4E
size: 4.6 (ID), 250(Length)
particle size(um) : 5
※ 编辑: bill00202000 (39.12.100.42), 02/06/2018 23:44:28
※ 编辑: bill00202000 (39.12.100.42), 02/06/2018 23:45:44
12F：→ tony15899: 稍微降低ACN浓度或是流速02/07 00:40
13F：→ tony15899: 也可以考虑减少进样量(稀释样品浓度)02/07 00:46
14F：→ tawin: 还有column温度可以改变看看02/08 00:36
15F：推 DEATH1122: 如果真的有两根peak 8/9分 但 重叠 就打稀一点的sample 02/08 20:32
16F：→ DEATH1122: 吧。 02/08 20:32
17F：推 sisay: NH2管柱分析糖的控温有希望分开 02/09 02:21
18F：→ sisay: 不过好像要高温 02/09 02:22
19F：推 zxcvb25206: 减少inj. Volumn不是解决方法 可从mp 流速 温度下手 02/09 19:10
20F：→ zxcvb25206: 比较实际 02/09 19:10
21F：→ zxcvb25206: 不同品牌的column与长度也会有差异 即便相同规格与长 02/09 19:12
22F：→ zxcvb25206: 度 不同牌都可能不一样 02/09 19:12
谢谢楼上的各位解答
管柱温度目前一直采用50度，
而流速部分已有尝试，降至0.5ml/min，对於peak低农度的标准品可分开，会在尝试各位
提供的建议，感谢万分
先在此祝大家新年快乐，狗年好运旺旺来
※ 编辑: bill00202000 (39.10.36.206), 02/12/2018 19:06:33
23F：推 tony15899: 依照原厂分析条件应该是不需要用到50度 02/13 13:29
24F：推 ynot010557: 买一只糖柱 用90度打 03/10 12:58
25F：→ ynot010557: (离子交换柱) 03/10 13:08